НОВОСТИ
БИБЛИОТЕКА
КАРТА САЙТА
ССЫЛКИ
О САЙТЕ
Глава 43. Возбудители гриппа
Грипп — распространенное острое инфекционное заболевание дыхательных путей, имеющее эпидемический характер и поражающее большие массы людей. Пандемия гриппа (1918-1920), получившая название «испанка», охватила почти 1,5 млрд. человек и унесла 20 млн. человеческих жизней.
Еще в начале XX века (1904) М. И. Афанасьев и П. Б. Вакс высказали предположение о вирусной природе инфекции. Однако установить это удалось только в 1933 г., когда Ч. Смитс, К. Эндрюс и П. Лейдлоу выделили от больных и изучили разновидности вирусов гриппа, названные вирусами гриппа типа А, в 1940 г. Т. Френсис и Т. Меджилл изучили вирусы гриппа В, а в 1947 г. Р. Тейлер открыл вирус гриппа С.
Возбудители гриппа относятся к семейству Orthomyxoviridae (от лат. myxomatosis — слизистый). Они обладают выраженным тропизмом к слизистым оболочкам верхних дыхательных путей.
Это семейство включает вирусы, вызывающие заболевания у человека, животных и птиц.
Морфологическая структура. Структура вирионов гриппа сложна. В ее составе имеются однонитчатая РНК, нуклеокапсид спиральной формы и защитная липидоуглеводопротеиновая оболочка. Количество капсомеров точно не установлено. Вирионы имеют в основном сферическую форму, но встречаются и вирионы нитевидной формы. Оболочка имеет выступы (шипы) — пепломеры (см. рис. 53). Р НК синтезируется в ядре клетки хозяина. Вирусные белки синтезируются в цитоплазме. Формирование вирионов происходит вблизи оболочки клетки.
Культивирование. Вирус гриппа хорошо размножается в курином эмбрионе (в клетках амниотической или аллантоисной полостей). Культивировать его можно также в культуре клеток почек обезьян, эмбриона человека и др.
Антигенная структура. Вирусы гриппа имеют S-антиген, по которому в реакции связывания комплемента они подразделяются на типы А, В, С.
У вируса А обнаружены еще два антигена: гемагглютинин и нейраминидаза (см. рис. 53).
Гемагглютинин имеет четыре подтипа (Н0, Н1, Н2, Н3), а нейраминидаза — два (N1 и N2). По сочетанию этих антигенов определяют подтип вируса, который меняется при разных эпидемиях. Так, эпидемию гриппа в 1933 г. вызвал вирус гриппа типа А, имевший формулу AH0N1. A H1N1 выделен при эпидемии 1947 г., AH2N2 — в 1957 г. (штамм Сингапур), AH3N2 — в 1968 г. (штамм Гонконг), в 1977 г. снова вернулся вирус типа AH1N1.
Вариабельность сочетания этих антигенов определяет изменчивость вируса А. Вирус типа В более устойчив. Самый устойчивый тип С. Типы и подтипы вирусов не дают перекрестного иммунитета.
Вирусы гриппа обладают общим антигеном с изоантигенами эритроцитов человека.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Температура 65° С губит вирусы гриппа через 5-10 мин. При 50° С он утрачивает свои инфекционные свойства через несколько минут. При комнатной температуре вирус инактивируется через несколько часов. В кислой, щелочной среде, под влиянием эфира и дезинфицирующих растворов он погибает очень быстро. Вирус очень чувствителен к действию УФ-лучей и ультразвуку. Он устойчив к действию глицерина, в котором может сохраняться несколько месяцев.
Восприимчивость животных. Во время эпидемических вспышек к вирусу гриппа могут адаптироваться домашние животные. Это выявлено увеличением у них титра антител. Но эпидемическая роль животных неизвестна. Может быть они являются хранителями вируса в природе и играют роль в его циркуляции.
Из экспериментальных животных можно заразить хорьков через дыхательные пути, интраназально — белых мышей. Заболевание у них характеризуется поражением легких, часто приводящим их к гибели.
Источники инфекции. Больной человек. Пути передачи. Воздушно-капельный (при разговоре, кашле, чиханье).
Патогенез. Вирус попадает на слизистую оболочку верхних дыхательных путей. Проникнув в организм человека, он внедряется в эпителиальные клетки верхних дыхательных путей, откуда проходит в кровь и вызывает явления интоксикации. В слизистой оболочке вирус вызывает гибель клеток. Это создает условия для проникновения других микроорганизмов, вызывающих вторичную инфекцию — пневмонию, бронхит и др. Активируются бактерии, локализующиеся в верхних дыхательных путях, — возникает аутоинфекция. Кроме того, вирус гриппа активирует хронические заболевания, такие как туберкулез и др.
Иммунитет. Формируется главным образом за счет антигемагглютининов, которые обладают вируснейтрализующими свойствами — препятствуют адсорбции вирусов на чувствительной клетке. Большую роль играют антинейраминидазные антитела. Защита организма обусловливается также интерфероном и другими ингибиторами, находящимися в сыворотке крови человека.
Обычно иммунитет носит типо- и штаммоспецифический характер. Смена подтипов вируса А исключает надежную защиту организма от этой инфекции, так как перекрестного иммунитета нет, а прогнозировать направление изменчивости пока не удается.
Профилактика. Изоляция больного, проветривание помещения, влажная уборка и т. д. Важно также предупреждение охлаждения, которое снижает выработку такого защитного фактора как интерферон.
Специфическая профилактика. В СССР используют живую вакцину, содержащую ослабленные вирусы типа А и В. Вводится вакцина интраназально. Получена живая вакцина для детей, которая вводится перорально. Ведутся исследования по созданию вакцины из гемагглютининов, нейраминидазы.
Для индивидуальной защиты пользуются интерфероном и оксалиновой мазью (смазывают слизистую носа).
Однако противогриппозные мероприятия не могут считаться достаточно эффективными. В СССР гриппом болеют 40-50 млн. человек в год, что наносит ущерб здоровью людей и экономике страны. Поэтому в настоящее время разрабатывается комплексная программа по борьбе с гриппом, в котором принимают участие многие (более 20) научно-исследовательские институты.
Лечение. При гриппе, вызванном вирусом А, нашел применение ремантадин. Для предупреждения вторичных инфекций используют различные антибактериальные препараты.
Вирусологическая диагностика
Цель исследования: выявление вируса и определение его типа; определение в сыворотке крови антител.
Материал для исследования
1. Отпечатки слизистой оболочки носовой полости (в острой стадии заболевания).
2. Носоглоточное отделяемое.
Способы сбора материала
Основные методы исследования
1. Культивирование смывов из носоглотки в куриных эмбрионах.
2. Риноцитоскопическое исследование.
3. Иммунофлюоресценция (см. главу 12).
4. Серологическое исследование парных сывороток в РСК и РТГА.
Контрольные вопросы
1. Опишите морфологическую структуру вируса гриппа.
2. Какие Вы знаете методы культивирования вирусов гриппа?
3. Какова антигенная структура вируса гриппа и какие Вы знаете типы его?
4. Какой тип вируса гриппа наиболее подвержен изменчивости и как называются выделенные штаммы (обозначения)?
5. Какова устойчивость вируса гриппа во внешней среде?
6. Почему при заболевании гриппом часто возникают вторичные инфекции?
7. Как и какой материал собирают для выявления вируса гриппа?
8. Чем обусловливается нестойкость иммунитета при гриппе?
9. Назовите основные методы исследования при лабораторной диагностике гриппа.
Лабораторная диагностика вирусных инфекций
Методы
исследования, применяющиеся для
лабораторной диагностики вирусных
заболеваний, разделены на три вида: 1)
Экспресс – диагностика. 2) Вирусологический
метод. 3) Серологический метод.
В
основе большинства методов диагностики
вирусных инфекций лежит реакция
взаимодействия вирусных антигенов и
специфических антител в жидкой среде.
Экспресс-диагностика
позволяет обнаружить вирус, его антигены
и нуклеиновые кислоты непосредственно
в исследуемом материале больного в
течение нескольких часов.
Для
экспресс-диагностики важно взять
материал у больного как можно раньше.
В зависимости от вида инфекции исследуют:
мазки и смывы из верхних дыхательных
путей, кровь, спинномозговую жидкость,
мочу, фекалии, содержимое везикул,
пустул, соскобы эпителия, кусочки органов
и др.
Материал
больного для исследования берут, соблюдая
правила асептики, чтобы предотвратить
внесение посторонней микрофлоры и не
инфицировать себя. Транспортируют пробы
в термосах со льдом.
Для
экспресс-диагностики вирусных заболеваний
применяют следующие методы:
а)
оптическая микроскопия (для обнаружения
внутриклеточных включений);
б)
электронная микроскопия (для обнаружения
вирионов);
в)
иммунная электронная микроскопия (для
обнаружения вируса после смешивания
вируссодержащего материала со
специфической сывороткой. В результате
взаимодействия антител с вирусами
образуются микропреципитаты. Образование
иммунных агрегатов повышает концентрацию
вирионов в микропрепарате, разрешающую
способность и специфичность метода).
Вирусоскопический
метод используется не для массовых
исследований.
Вирусологический
метод
основан на накоплении (культивировании)
вируса, на выявлении (индикации) вируса
и определении его вида (идентификации).
В
зависимости от применения определенного
метода культивирования вируса возможно
проведение вирусологического исследования
в трех направлениях:
1.
Использование
для выделения вирусов лабораторных
животных,
чувствительных к предполагаемому
возбудителю инфекции. Заражение животных
проводят с учетом тропизма вирусов к
определенным тканям. Методы заражения
могут быть разными: интраназальное, в
головной и спинной мозг, в глаз, через
пищеварительный тракт, под кожу,
внутрикожно, внутримышечно, внутривенно
и др.
После
заражения ведут тщательное наблюдение
за внешним видом и поведением подопытных
животных.
Появление
клинических признаков заболевания, как
общих, так и местных, и их развитие, а
также наличие летальных исходов
свидетельствует о развитии инфекции и
наличии вируса у животных. Идентификацию
выделенного возбудителя проводят с
помощью реакции биологической
нейтрализации (РБН).
2.
Более доступный и удобный метод для
выделения вирусов от больных – заражение
куриных эмбрионов.
В результате размножения вируса возможны
гибель эмбриона, накопление возбудителя
в аллантоисной и амниотической жидкостях.
Индикацию вируса в указанных жидкостях
проводят в РГА. Для его идентификации
используют РТГА.
3.
Наиболее широко для выделения вирусов
используются культуры
клеток.
Перед заражением из пробирки с культурой
клеток удаляют питательную среду и
вносят исследуемый материал. После
добавления поддерживающей среды
зараженные культуры инкубируют при
360С
и проверяют на наличие ЦПД в течение
4-8 дней, начиная со 2-го дня после
инфицирования. Появление ЦПД говорит
об индикации вируса. Выявление вируса
можно провести также с помощью цветной
пробы и реакции гемадсорбции (РГА).
С
целью идентификации выделенного вируса
используют иммунологические методы –
реакцию тканевой нейтрализации (РТН),
РИФ, РТГА, ИФА, РНГА, радиоиммунный метод
(РИМ), реакцию преципитации в геле и ПЦР.
Серологический
метод.
С целью серодиагностики вирусной
инфекции у больного для исследования
берут две пробы сыворотки крови: взятие
первой порции осуществляется сразу при
подозрении на вирусную инфекцию, а
вторую – через 10-14 дней после первой.
При одновременном исследовании парных
сывороток результат считается
положительным в двух случаях: 1) когда
в первой пробе нет антител, а во второй
появились антитела, 2) если в первой
пробе уже были антитела, а во второй
отмечается диагностическое нарастание
титра антител не менее чем в четыре
раза.
При
нормальном иммунном ответе на вирусную
инфекцию доминируют антитела класса
IgM
и IgJ.
Антитела IgJ
обнаруживаются через две недели и
циркулируют длительное время, антитела
класса IgM
появляются рано (на 3-5 день болезни) и
исчезают через несколько месяцев.
Поэтому обнаружение IgM
является надежным методом быстрой
диагностики и свидетельствует о текущей
инфекции даже при наличии одной сыворотки,
взятой в первые дни заболевания.
Наиболее
употребительными методами серодиагностики
являются ИФА, РТГА, РНГА и РТН.
Соседние файлы в папке Лекции 5 семестр
Вирусы
Вирусные заболевания возникли в глубокой древности, однако вирусология как наука начала развиваться в конце XIX века.
В 1892 г. русский ученый-ботаник Д. И. Ивановский, изучая мозаичную болезнь листьев табака, установил, что заболевание это вызывается мельчайшими микроорганизмами, которые проходят через мелкопористые бактериальные фильтры. Эти микроорганизмы получили название фильтрующихся вирусов (от лат. virus — яд). В дальнейшем было показано, что имеются и другие микроорганизмы, проходящие через бактериальные фильтры, поэтому фильтрующиеся вирусы стали называть просто вирусами.
Вопрос о происхождении вирусов является предметом многих исследований и дискуссий. Одни ученые предполагают, что вирусы являются потомками неклеточных форм живых паразитических микроорганизмов. Другие считают, что вирусы возникли в результате регрессивной эволюции одноклеточных микроорганизмов. Третьи думают, что вирусы произошли из клеточных элементов, ставших автономными системами.
Большой вклад в изучение вирусов внесли советские вирусологи: М. А. Морозов, Н. Ф. Гамалея, Л. А. Зильбер, М. П. Чумаков, А. А. Смородинцев, В. М. Жданов и др.
Вирусы — это неклеточная форма существования живой материи. Они очень малы. По образному выражению В. М. Жданова «величину их по отношению к величине средних бактерий можно сравнить с величиной мыши по отношению к слону». Увидеть вирусы стало возможным только после изобретения электронного микроскопа.
В настоящее время для изучения вирусов используют много методов: химические, физические, молекулярно-биологические, иммунобиологические и генетические.
Все вирусы подразделяются на поражающие человека, животных, насекомых, бактерии и растения.
У вирусов наблюдается большое разнообразие форм и биологических свойств, однако все они имеют общие черты строения. Зрелые частицы вирусов называют вирионами.
В отличие от других микроорганизмов, содержащих одновременно ДНК и РНК, вирион содержит только одну из нуклеиновых кислот — либо ДНК, либо РНК.
Нуклеиновая кислота вирусов может быть однонитчатой и двунитчатой. Почти все вирусы, содержащие РНК, имеют в своем геноме однонитчатую РНК, а содержащие ДНК — двунитчатую ДНК. В соответствии с двумя типами генетического вещества вирусы подразделяют на РНК- и ДНК-содержащие. К ДНК-содержащим относятся 5 семейств, РНК-содержащим — 10 семейств.
Структура вириона. В центре вириона находится нуклеиновая кислота, которая окружена капсидом (от греч. kanca — ящик). Капсид состоит из белковых субъединиц, называемых капсомерами. Зрелый вирус по химической структуре является нуклеокапсидом. Количество капсомер и способ их укладки (рис. 52) строго постоянны для каждого вида вируса. Например, вирус полиомиелита содержит 32 капсомера, а аденовирус — 252 капсомера. Капсомеры могут быть уложены в виде многогранника с равномерными симметричными гранями — кубоидальная форма (например, аденовирус). Укладка в виде спиралей (сферическая) характерна для вирусов гриппа. Может быть тип симметрии, при котором нуклеиновая кислота имеет вид пружины, вокруг которой уложены капсомеры, в этом случае вирус имеет палочковидную форму — вирус, вызывающий болезнь листьев табака.
Рис. 52. Схематическое изображение расположения капсомеров в капсиде вирусов. а — вирус гриппа; б — аденовирус; в — вирус герпеса; г — вирус полиомиелита
Сложный тип симметрии имеет фаг: головка — кубоидальной, а отросток — палочковидной формы (сперматозоидная форма) (см. рис. 21, 22).
Таким образом, в зависимости от способа укладки вирусы подразделяют на кубоидальную, сферическую, палочковидную и сперматозоидную формы.
Некоторые вирусы, обладающие более сложной структурой, имеют оболочку, которая называется пеплос. Она образуется при выходе вируса из клетки хозяина. Вирусный капсид при этом обволакивается внутренней поверхностью цитоплазматической мембраны клетки хозяина и образуется один или несколько слоев оболочки суперкапсид. Такую оболочку имеют только некоторые вирусы, например вирусы бешенства, герпеса, энцефалита. Эта оболочка содержит фосфолипиды, разрушающиеся под воздействием эфира. Таким образом, воздействуя эфиром, можно отличить вирус, имеющий пеплос, от вируса с «голым капсидом».
У некоторых вирусов из внешнего липидного слоя оболочки выступают капсомеры в виде шипов (эти шипы тупые). Такие вирусы называются пепломерами (например, вирус гриппа, см. рис. 52).
Нуклеиновая кислота вируса является носителем наследственных свойств, а капсид и внешняя оболочка несут защитные функции, как бы оберегая нуклеиновую кислоту. Кроме того, они способствуют проникновению вируса в клетку.
Размеры вирусов. Измеряются вирусы в нанометрах. Величина их колеблется в широком диапазоне от 15-20 до 350-400 нм.
Методы измерения вирусов: 1) фильтрование через бактериальные фильтры с известной величиной пор; 2) ультрацентрифугирование — крупные вирусы осаждаются быстрее; 3) фотографирование вирусов в электронном микроскопе.
Химический состав вирусов. Количество и содержание ДНК и РНК вирусов неодинаковы. У ДНК молекулярная масса колеблется от 1·106 до 1,6·108, а у РНК — от 2·106 до 9,0·106.
Белки у вирионов обнаружены в незначительном числе, они состоят из 16-20 аминокислот. Кроме капсидных белков, имеются еще внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой. Белки обусловливают антигенные свойства вирусов, а также в силу плотной укладки полипептидных цепей ограждают вирус от действия ферментов клетки хозяина.
Липиды и углеводы обнаружены во внешней оболочке сложных вирионов. Источником липидов и углеводов является оболочка клетки хозяина. Полисахариды, входящие в состав некоторых вирусов, обусловливают способность их вызывать агглютинацию эритроцитов.
Ферменты вирусов. Вирусы не имеют собственного метаболизма, поэтому они не нуждаются в ферментах обмена веществ. Однако у некоторых вирусов выявлено наличие ферментов, способствующих проникновению их в клетку хозяина. Например, у вируса гриппа А обнаружена нейраминидаза, отщепляющая нейраминовую кислоту, содержащуюся в оболочках животных клеток (эритроцитов и др.). У фагов — лизоцим, разрушающий клеточную оболочку, фосфатаза и др.
Выявление вирусных антигенов. Вирусные антигены в инфицированных клетках хозяина можно обнаружить с помощью метода иммунофлюоресценции. Препараты, содержащие клетки, инфицированные вирусами, обрабатывают специфическими иммунными люминесцирующими сыворотками. При просмотре в люминесцентном микроскопе в местах скопления вирусных частиц наблюдается характерное свечение. Вид вируса определяют по соответствию специфической люминесцирующей сыворотки, вызвавшей свечение.
Внедрение вируса в клетку, взаимодействие его с клеткой хозяина и репродукция (размножение) слагаются из ряда последовательных стадий.
Стадия 1. Начинается с процесса адсорбции за счет рецепторов вириона и клетки. У сложных вирионов рецепторы располагаются на поверхности оболочки в виде шиловидных выростов (вирус гриппа), у простых вирионов — на поверхности капсида.
Стадия 2. Проникновение вируса в клетку хозяина протекает по-разному у разных вирусов. Например, некоторые фаги протыкают оболочку своим отростком и впрыскивают нуклеиновую кислоту в клетку хозяина (см. главу 8). Другие вирусы попадают в клетку путем втягивания вирусной частицы с помощью вакуоли, т. е. на месте внедрения в оболочке клетки образуется углубление, затем края ее смыкаются и вирус оказывается в клетке. Такое втягивание называется виропексис.
Стадия 3. » Раздевание вируса» (дезинтеграция). Для своего воспроизведения вирусная нуклеиновая кислота освобождается от защищающих ее белковых покровов (оболочки и капсида). Процесс раздевания может начаться во время адсорбции, а может произойти тогда, когда вирус находится уже внутри клетки.
Стадия 4. На этой стадии происходит репликация (воспроизведение) нуклеиновых кислот и синтез вирусных белков. Эта стадия происходит при участии ДНК или РНК клетки хозяина.
Стадия 5. Сборка вириона. Этот процесс обеспечивается самосборкой белковых частиц вокруг вирусной нуклеиновой кислоты. Синтез белка может начаться непосредственно после синтеза вирусной нуклеиновой кислоты либо после интервала в несколько минут или несколько часов. У одних вирусов самосборка происходит в цитоплазме. У других в ядре клетки хозяина. Образование внешней оболочки (пеплоса) всегда происходит в цитоплазме.
Стадия 6. Выход вириона из клетки хозяина происходит путем просачивания вируса через оболочку клетки либо через отверстие, образовавшееся в клетке хозяина (в этом случае клетка хозяина погибает).
Типы взаимодействия вируса и клетки. Первый тип — продуктивная инфекция — характеризуется образованием новых вирионов в клетке хозяина.
Второй тип — абортивная инфекция заключается в том, что обрывается репликация нуклеиновой кислоты.
Третий тип — характеризуется встраиванием вирусной нуклеиновой кислоты в ДНК клетки хозяина; возникает форма сосуществования вируса и клетки хозяина (вирогения). В этом случае обеспечивается синхронность репликации вирусной и клеточной ДНК. У фагов это называется лизогения.
Микроскопическое исследование. При отдельных вирусных инфекциях в цитоплазме или ядрах клеток организма хозяина наблюдаются специфические внутриклеточные тельца — включения, имеющие диагностическое значение (тельца Бабеша — Негри при бешенстве, тельца Гварниери при оспе и др.). Размеры вирусных частиц и телец-включений удается искусственно увеличить специальными методами обработки препаратов с протравой и импрегнацией (например, метод серебрения по Морозову) и наблюдать при иммерсионной микроскопии. Более мелкие вирионы, лежащие за пределами видимости оптического микроскопа, обнаруживаются только при электронной микроскопии. Существуют разные точки зрения в отношении внутриклеточных включений. Одни авторы считают, что они представляют собой скопление вирусов. Другие считают, что они возникают в результате реакции клетки на внедрение вирусов.
Генетика вирусов. Модификация (ненаследуемые изменения) у вирусов обусловливается особенностями клетки хозяина, в которой происходит репродукция вируса. Модифицированные вирусы приобретают способность заражать клетки, аналогичные тем, в которых они модифицировались. У разных вирусов модификация по-разному проявляется. Например, у фагов изменяется форма «негативных пятен» (фаговых колоний).
Мутация — у вирусов возникает под влиянием тех же мутагенов, которые вызывают мутацию у бактерий (физические и химические факторы). Возникает мутация во время репликации нуклеиновых кислот. Мутации затрагивают различные свойства вирусов, например чувствительность к температуре и др.
Генетическая рекомбинация у вирусов может возникнуть в результате одновременного заражения клетки хозяина двумя вирусами, при этом может произойти обмен отдельными генами между двумя вирусами и образуются рекомбинанты, содержащие гены двух родителей.
Генетическая реактивация генов иногда происходит при скрещивании инактивированного вируса с полноценным, что приводит к спасению инактивированного вируса.
Спонтанная и направленная генетика вирусов имеет большое значение в развитии инфекционного процесса.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Большинство вирусов инактивируется при действии высоких температур. Однако имеются исключения, например вирус гепатита термоустойчив.
К низким температурам вирусы не чувствительны, ультрафиолетовые солнечные лучи оказывают инактивирующее действие на вирусы. Рассеянный солнечный свет действует на них менее активно. Вирусы устойчивы к глицерину, что дает возможность длительно сохранять их в глицерине. Они устойчивы к антибиотикам (при культивировании вирусов исследуемый материал обрабатывают антибиотиками для подавления бактериальной флоры).
Кислоты, щелочи, дезинфицирующие вещества инактивируют вирусы. Однако некоторые вирусы, инактивированные формалином, сохраняют иммуногенные свойства, что позволяет использовать формалин для получения вакцин (вакцина против бешенства).
Восприимчивость животных. Круг восприимчивых животных для некоторых вирусов очень широк, например к вирусам бешенства чувствительны многие животные. Некоторые вирусы поражают только один вид животного, например вирус чумы собак поражает только собак. Имеются вирусы, к которым животные не чувствительны — например, вирус кори и т. д.
Органотропность вирусов. Вирусы обладают способностью поражать определенные органы, ткани и системы. Например, вирус бешенства поражает нервную систему. Вирус оспы обладает дермотропностью и т. д.
Выделение вирусов в окружающую среду. Из больного организма вирусы могут выделяться с калом, например вирус полиомиелита и другие энтеровирусы. Вирус бешенства выделяется со слюной, вирус гриппа — с отделяемым слизистой носоглотки и т. д.
Основные пути передачи вирусов. Воздушно-капельный (грипп, оспа), пищевой (полиомиелит, гепатит А), контактно-бытовой (бешенство), трансмиссивный (энцефалит).
Противовирусный иммунитет. Организм человека обладает врожденной устойчивостью к некоторым вирусам. Например, человек не чувствителен к вирусу чумы собак. Животные не чувствительны к вирусу кори. В этих случаях противовирусный иммунитет основан на отсутствии клеток, способных поддерживать репродукцию вирусов.
Противовирусный иммунитет обусловливается как клеточными, так и гуморальными факторами защиты, неспецифическими и специфическими. Неспецифические факторы. Мощным ингибитором репродукции вирусов является белковое вещество — интерферон. В здоровом организме он содержится в незначительном количестве, а вирусы способствуют продукции интерферона и количество его значительно увеличивается. Он неспецифичен, так как блокирует репродукцию разных вирусов. Однако он обладает тканевой специфичностью, т. е. клетки разных тканей образуют неодинаковый интерферон. Считают, что механизм действия его заключается в том, что он препятствует синтезу белка в клетке хозяина и этим прекращает репродукцию вируса.
К специфическим факторам противовирусного иммунитета относятся вируснейтрализующие антитела, гемагглютинирующие и преципитирующие.
Методы культивирования вирусов. Вирусы размножаются только в жизнеспособных клетках. Их культивируют: в куриных эмбрионах (рис. 53), культурах ткани человека и различных животных, в организме чувствительных животных, восприимчивых членистоногих.
Рис. 53, Куриный эмбрион. 1 — хорион-аллантоис: 2 — аллантоисная полость; 3 — амниотическая полость; 4 — желточный мешок; 5 — воздушный мешок; 6 — подскорлупная оболочка
В первый период развития вирусологии основным методом изучения вирусов являлось искусственное заражение животных, но этот метод сложный, и кроме этого животные ко многим вирусам оказались невосприимчивы.
Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах и в культуре клеток тканей человека и животных.
Заражение куриных эмбрионов. Для репродукции вирусов используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37° С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой.
Пригодность куриного эмбриона для заражения определяется по наличию движений эмбриона и развитой сети кровеносных сосудов на хорион-аллантоисной оболочке при просвечивании с помощью овоскопа.
Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают (см. рис. 53):
1) на хорион-аллантоисную оболочку,
2) в аллантоисную полость;
3) в амниотическую полость;
4) в желточный мешок.
Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку. После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого конца, снимают подскорлупную оболочку — при этом обнаруживается хорион-аллантоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят на хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверстие закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином.
На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.
Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие в скорлупе на глубину 213 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком, после чего оба отверстия заливают парафином.
Заражение в аллантоисную полость. Заражение проводят в затемненном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.
Заражение в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный мешок был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объеме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.
Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств введенного вируса.
Инфицированные яйца ежедневно проверяют — овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта.
При необходимости раздельно исследовать каждую составную часть эмбриона материал собирают в определенном порядке: отсасывают аллантоисную жидкость, затем амниотическую жидкость, разрезают хорион-аллантоисную оболочку, отделяют амниотическую оболочку, эмбрион, желточный мешок и только после этого извлекают хорион-аллантоисную оболочку, отделив ее от внутренней поверхности скорлупы. Наличие вируса в зараженном эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона.
Вирусы, не обладающие гемагглютинирующей активностью, выявляют с помощью РСК.
Для выявления вируса в аллантоисной или амниотических жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА (гемагглютинация вызывается аллантоисной или амниотическими жидкостями или взвесью, приготовленной из хорион-аллантоисной оболочки).
Культивирование вирусов в культуре клеток. Для накопления вирусов в чувстсительных клеточных культурах используются ткани человека и различных животных. Наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток.
Однослойные культуры клеток выращивают в стеклянных плоских сосудах-матрацах. Клеточная суспензия в жидкой питательной среде при температуре 37° С позволяет получить «in vitro» слой клеток с определенной гистологической структурой. Присутствие вирусов в культурах тканей обнаруживают по изменению (дегенерации) клеток. Тип вирусов определяют путем нейтрализации действия вирусов при добавлении к вируссодержащему материалу соответствующих типоспецифических сывороток.
Эти методы позволяют быстрее учитывать результаты исследования и являются более экономичными. В тех случаях, когда вирусы не вызывают цитопатического действия (дегенерации) и не развиваются в куриных эмбрионах, пользуются методами заражения животных (см. главу 11).
Для культивирования вирусов используют перевиваемые клетки, которые чаще получают из клеток злокачественных опухолей.
Однослойные культуры получают из эмбрионов человека, курицы, животных.
Преимущество однослойных культур клеток — простота методики и легкость учета.
Способность клеток к размножению вне организма связана со степенью дифференциации ткани. Менее дифференцированные ткани обладают большей способностью к пролиферации (соединительная, эпителиальная ткань).
Сущность методов при приготовлении первичных культур ткани заключается в разрушении межклеточной ткани и разобщении клеток для последующего получения монослоя.
Разобщение клеток проводится путем воздействия на ткань протеолитических ферментов, чаще всего трипсина. Раствор трипсина способствует разъединению клеток при сохранении у них способности к размножению. Для выращивания культуры клеток необходима питательная среда. Состав среды сложный, он включает целый ряд ингредиентов: аминокислоты, глюкозу, витамины, минеральные соли, коферменты и т. д. Получение культуры ткани проводят в строго асептических условиях. В среду добавляются антибиотики (500 ЕД пенициллина и 250 ЕД стрептомицина в 1 мл) для подавления роста бактериальной флоры.
Подготовленную ткань заливают 0,25% раствором подогретого трипсина и инкубируют в термостате при 37° С. Во время инкубации ткань периодически помешивают путем вращения колбы. Трипсинизированные клетки центрифугируют при 800-1000 об/мин в течение 5 мин.
Трипсинизацию и центрифугирование проводят очень осторожно, чтобы не травмировать клетки. После центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, а осадок клеток помещают в небольшой объем питательной среды. Для получения однородной массы взвесь клеток фильтруют через один слой марли в воронке (стерильной). Взвесь клеток проверяют на стерильность путем посева по 0,1 мл , в 2 пробирки с сахарным бульоном.
Успех культивирования клеток зависит от посевной Дозы, поэтому после трипсинизации производят подсчет клеток в камере Горяева. После подсчета взвесь клеток разводят питательной средой из такого расчета, чтобы в 1 мл содержалось 500000-1000000 клеток и разливают по пробиркам и матрацам. Пробирки с культурой ткани инкубируют в термостате в наклонном положении.
Посеянные культуры ежедневно просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера их роста. Нормальные пролиферирующие клетки светлые и растут однослойным пластом. Если клетки темные, зернистые и не пролиферируют, что может быть результатом загрязнения (плохая обработка посуды или загрязнение ингредиентов), то такие культуры изымают из опыта.
Смена питательной среды через 2-3 дня после посева улучшает интенсивность пролиферации.
Нормальные, хорошо пролиферирующие клетки заражают исследуемым материалом.
Перевиваемые культуры преимущественно получают из злокачественных опухолей. Штамм Hela — культура клеток рака шейки матки женщины по имени Helena (получен в 1950 г.); штамм Нер-2 выделен от больного раком гортани. Рост этих клеток поддерживается в лабораториях путем последовательных пассажей. Особенность их заключается в том, что они размножаются в течение длительного срока. В настоящее время эти клетки прошли уже тысячи генераций. В процессе пассажей они теряют некоторые морфологические и биохимические свойства — подвергаются мутации. Однако остаются вполне пригодными для культивирования в них вирусов. Культурой этих клеток пользуются лаборатории всего мира.
Размножение вируса в культуре клеток происходит в различные сроки в зависимости от свойств вируса и вида клеток.
О наличии вируса судят по цитопатическому действию. В микроскопе наблюдается дегенерация клеток. Время цитопатического действия и его характер зависят от дозы и свойств вируса.
У некоторых вирусов цитопатическое действие обнаруживается через несколько дней (вирус оспы), у других — через 1-2 нед (вирус гепатита и др.).
В настоящее время известны уже сотни вирусов, поражающих человека. Борьба с вирусными инфекциями осуществляется разными методами. Наиболее эффективна иммунизация. Таким способом ликвидирована оспа, сокращена заболеваемость полиомиелитом. Важное значение в борьбе с вирусными инфекциями имеют общественная профилактика — уничтожение бродячих собак (борьба с бешенством), личная профилактика и т. д.
Однако эти меры не могут обеспечить ликвидацию всех вирусных заболеваний. Ученые настойчиво ищут пути, при помощи которых можно было бы поразить вирус, не повредив клетку, в которой он находится.
Поэтому закономерно, что в программе КПСС вирусология названа одной из ведущих отраслей естественнонаучных знаний, которая должна получить преимущественное развитие в ближайшие годы.
Основные методы исследования вирусов. 1. Реакция гемагглютинации, реакция задержки гемагглютинации, реакция непрямой гемагглютинации. Реакция связывания комплемента.
2. Реакция нейтрализации вирусов в культуре тканей.
3. Метод иммунофлюоресценции.
4. Гистологический метод — выявление включений (телец Бабеша — Негри — при бешенстве; телец Пашена — при оспе и др.).
5. Биологический метод.
Для любителей порно с мамами, мы подобрали целый каталог отборной порнушки в HD, где вы можете посмотреть самое качественное, красивое и отборное порно! Также, на нашем портале мы создали более 150 разделов на любой цвет и вкус!
Влияние физических и химических факторов на жизнеспособность вирусов
Устойчивость
вирусов к кислотам и щелочам у разных
видов различна. Каждый вирус имеет
характерную для него зону стабильности,
в пределах которой он сохраняет
жизнеспособность. Одни вирусы устойчивы
к кислотам и щелочам, а другие чувствительны
к изменениям реакции среды и сохраняют
активность только в узких пределах
концентрации водородных ионов.
Вирусы
различны также по устойчивости в солевых
растворах.
Все
окислители инактивируют вирусы в той
или иной степени (перекись водорода,
марганцовокислый калий, концентрированные
растворы мочевины).
Наиболее
сильное действие на все вирусы оказывает
лизол (5% раствор), инактивирующий вирусы
через 1-5 мин.
Наилучшим
консервантом для многих вирусов является
50% глицерин, который сохраняет
жизнеспособность в течение нескольких
месяцев.
Облучение
вирусов ультрафиолетовыми лучами
инактивирует их. Дозы и время облучения
различны для разных вирусов. Вирусы
обладают устойчивостью к ионизирующему
облучению.
Различно
отношение вирусов к высоким температурам.
Большинство из них инактивируется при
550С-600С
в течение 5-30 мин. Некоторые вирусы
выдерживают нагревание до 800С
в течение 30 мин. Все вирусы хорошо
сохраняются при температуре – 700С
и ниже.
Длительное
время они остаются жизнеспособными при
высушивании под вакуумом из замороженного
состояния.
Глава 47. Возбудители гепатита
Инфекционный гепатит известен давно. Еще Гиппократ описал заразную форму желтухи. Но только в 1883 г. русский врач С. П. Боткин после длительных наблюдений и исследований пришел к выводу о том, что это заболевание инфекционной природы. В честь Боткина инфекционный гепатит был назван его именем «болезнь Боткина».
Предположение о вирусной этиологии гепатита было высказано в 1937 г. при изучении вспышки желтухи после массовой иммунизации солдат.
В настоящее время известно, что вирусный гепатит объединяет два самостоятельных заболевания: гепатит А — инфекционный, гепатит В — сывороточный, Возбудители этих заболеваний относятся к разным квалификационным группам.
Вирус гепатита А
Выявлен Фейстоном и другими в 1973 г. в фекалиях больного при помощи электронной микроскопии.
Морфологическая структура. Это мелкий вирус (20-25 нм). Тип нуклеиновой кислоты окончательно не установлен. Предполагают, что он содержит РНК. Форма вируса кубоидальная. Он состоит из нуклеоида и внешней оболочки.
Вирус типа А называют HAV (hepatitis A virus).
Культивирование. Вирусы не репродуцируются в клеточных культурах, но их удается культивировать в организме южноамериканских обезьян.
Антигенная структура. У вируса гепатита А не обнаружены серотипы. Он взаимодействует только с антителами HAV.
Устойчивость к факторам окружающей среды. Вирусы типа А довольно устойчивы. Полная их инактивация происходит только при кипячении в течение 30-40 мин. Они хорошо переносят низкие температуры, высушивание, воздействие кислот, эфира, не разрушаются под действием УФ-лучей. Обычные концентрации дезинфицирующих растворов губят их через 40-60 мин.
Восприимчивость животных. К вирусу гепатита типа А чувствительны обезьяны (шимпанзе).
Источники инфекции. Больные люди с клинически выраженной желтушной и безжелтушной формой заболевания.
Пути передачи. H AV передается преимущественно пищевым путем. Мухи могут быть механическими переносчиками. Вирус чаще передается в первые дни болезни.
Патогенез. Основной путь проникновения вируса — через слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Попав в желудочно-кишечный тракт, HAV проникает в эпителиальные клетки слизистой оболочки кишечника, а оттуда в кровь. Возникает вирусемия. С кровью вирусы разносятся по всему организму и поражают паренхиматозные органы. Наибольшим тропизмом HAV обладает к гепатоцитам (клеткам печени), в цитоплазме которых вирус репродуцируется. При этом нарушается белковый и углеводный обмен. В крови появляются желчные кислоты, кал обесцвечивается, а моча темнеет. Нарушение углеводного обмена приводит к увеличению в сыворотке крови ферментов: альдолазы и трансфераз. Вирусом гепатита А чаще заражаются дети в возрасте от 1 года до 15 лет.
Иммунитет. Постинфекционный иммунитет стойкий. Антитела относятся к IgM и IgG (см. главу 12).
Профилактика. Изоляция больных, обеззараживание испражнений, мокроты больных, общесанитарные мероприятия.
Специфическая профилактика. Детям в возрасте от 3 до 15 лет, контактировавшим с больным гепатитом, вводят иммуноглобулин, что снижает заболеваемость, а в случае заболевания облегчает тяжесть течения.
Вирус гепатита В
Парентеральный сывороточный гепатит вызывается вирусом типа В. Он называется HBV (hepatitis В virus).
В 1961 г. Блумберг с соавторами в сыворотке крови больных обнаружила антиген, который был назван австралийским. А в 1970 г. Дейн также в сыворотке крови больных гепатитом обнаружил более крупные частицы, которые назвали частицами Дейна.
Морфологическая структура. Вирус HBV встречается в трех морфологических формах.
1. Мелкие сферические частицы — 22 нм в диаметре.
2. Трубчатые частицы разной длины. Полагают, что эти две формы представляют собой свободные белковые частицы — капсиды.
3. Вирусоподобные частицы — 40 нм (описаны Дейном и называются частицами Дейна). Они имеют двунитчатую ДНК. У них обнаружены липиды, полипептиды, углеводы и двойная оболочка. В настоящее время их считают полноценным вирионом — собственно HBV.
Культивирование. Вирус гепатита типа В репродуцируется в культуре гепатоцитов эмбриона человека, в диплоидных клетках печени человека, а также в органах и тканях обезьян шимпанзе. Культивировать вирус сложно, что затрудняет диагностику.
Антигенная структура. У частиц Дейна обнаружен HBV-антиген. Это сложный антиген, в состав которого входят: полипептиды, углеводы, липиды. Антитела, образующиеся к нему, называются анти-HBS. В сердцевине частицы Дейна имеется cor-антиген, — антитела к нему называются анти-НВс.
Устойчивость к факторам окружающей среды. При температуре 60° С вирус сохраняется 3-4 ч. Низкие температуры на него не действуют. В замороженных препаратах крови он остается жизнеспособным до 20 лет. H BV устойчивы к эфиру. 5% раствор формалина инактивирует их через 12 ч, 3% раствор хлорамина — через 2 ч.
Источники инфекции. Кровь больных и носителей антигена.
Пути передачи. Гепатит типа В передается парентерально при инъекциях вакцин, сывороток, лекарств, нестерильными зараженными вирусом гепатита иглами, шприцами, скарификаторами.
Патогенез. Инкубационный период при гепатите типа В — 2-6 мес (при гепатите А — 3-6 нед.) Проникнув гематогенно, лимфогенным путем, HBV попадает в печень, в дальнейшем заболевание развивается так же, как при гепатите, вызванном HAV. Дифференциальная диагностика гепатитов А и В по клиническим данным затруднена.
Профилактика. Наибольшее значение для профилактики гепатита типа В имеет правильная стерилизация инструментов и отбор доноров при использовании их крови. Донорскую кровь проверяют на наличие HBS-антигена.
Профилактические мероприятия в отношении медицинского персонала, работающего с материалом, инфицированным HBV, основаны на соблюдении особой осторожности при работе с кровью (обработке рук, загрязненных кровью, 2% раствором перекиси водорода и т. д.).
Специфическая профилактика. Лицам, подвергшимся опасности заражения, вводят иммуноглобулин.
В настоящее время разрабатывается вакцина, приготовленная из НВS-антигена.
Для диагностики гепатитов А и В широко используются биохимические показатели сыворотки крови больных, которые отражают функциональное состояние печени. О нарушении пигментного обмена функции печени судят по количеству свободного и связанного билирубина в сыворотке. Для выявления нарушения белково-синтетической функции ставят тимоловую пробу. Все эти исследования проводят в клинических лабораториях.
Вирусологические тесты диагностики HAV. Вирусологическая диагностика проводится путем определения антигенов и антител в крови. Для этой цели применяют наиболее чувствительные серологические методы: РПГ (реакция преципитации в геле), встречный иммуноэлектрофорез и др. Разработаны серологические методы для ранней и ретроспективной диагностики вирусного гепатита: в острой форме диагноз сводится к выявлению вируса в фекалиях больных методом иммуноэлектронной микроскопии с сывороткой реконвалесцентов.
Ретроспективная диагностика гепатита А осуществляется методом исследования парных сывороток крови больного в РСК и РПГ (см. главу 12).
Вирусологические тесты диагностики HBV. 1. В острой стадии диагностика осуществляется путем выявления HBS-антигена в сыворотке крови больного.
2. Выявление анти-НВS в РСК. Анти-HBS появляются только через 2-4 нед после начала заболевания и длительно циркулируют в крови.
3. Ретроспективная диагностика гепатита В осуществляется путем определения анти-HBS в парных сыворотках крови больного в реакции преципитации в геле (см. главу 12).
1. Какие заболевания вызывают вирусы гепатита и каковы пути передачи?
2. Какова устойчивость вирусов гепатита?
3. Какие иммуноглобулины обусловливают иммунитет после инфекционного гепатита А?
4. Что такое частицы Дейна?
5. Какие показатели используют для лабораторной диагностики гепатита А и В?
6. Какие исследования проводятся для ретроспективной диагностики при гепатитах А и В?
Вас можно назвать огромным ценителем любительского порно? В таком случае не проходите мимо этого ресурса, он непременно заинтересует Вас своим множеством порнушки только в лучшем качестве, с самыми сексуальными девками и самыми эротичными позами, и все доступно
